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本发明公开了一种生物巯基荧光探针，所述探针采用第一荧光基团做发射荧光的能量供体，第二荧光基团或淬灭基团做吸收荧光的能量受体，所述探针结构为R-S-S-R’，其中，R含有第一荧光基团，R’含有第二荧光基团或淬灭基团。本发明还提供了所述生物巯基荧光探针的制备方法和应用。本发明利用生物巯基探针自身荧光强度衰减或淬灭，提高了成像信噪比，同时，与巯基反应后的荧光稳定性高；本发明的荧光探针的制备方法简单，可在常温、常压、中性pH条件下进行。