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本发明提供一种基于焦点调制的荧光显微系统及方法，该荧光显微系统包括光源组件、光路调制组件、聚光组件及光电检测组件；光源组件产生入射光束；光路调制组件将所述光束分离为非调制光束和待调制光束；非调制光束通过聚光组件形成的初始显微光路后聚焦照射至样品目标区域；光路调制组件为待调制光束提供一与该初始显微光路共轭的一共轭光路，且光路调制组件能够周期性调制所述共轭光路的共轭位置，调制光束进入所述初始显微光路，调制光束和非调制光束在成像物镜焦点处发生干涉；光电检测组件接收样品目标区域产生的光信号，并将光信号转换为电信号。本发明实施例可以提高荧光显微镜的纵向分辨率、信噪比及成像探测深度。