一种从酶转化液中分离提取2酮丁酸的方法。采用酶催化法生产2酮丁酸时，酶催化液中除了含有2酮丁酸，还含有菌体、水溶性蛋白、色素、苏氨酸、钠盐等杂质，由于2酮丁酸具有在水相和有机相中易容、沸点低等特点，故分离提取困难。本方法首先通过双膜即微滤膜、超滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和色素，膜过滤液依次通过粉末活性炭脱色、加碱除蛋白、减压浓缩、阳离子交换柱除杂质、冷冻真空干燥操作步骤，得到纯度95.0％以上的2酮丁酸结晶，收率达到80％以上。本发明采用微滤和超滤双膜过滤菌体蛋白，菌体去除彻底，过滤液澄清透明；采用阳离子交换工艺除杂质，高效去除难分离的苏氨酸、钠盐等杂质。